校正染料（ROX）能够有效修正样品加样误差或孔间误差，提供稳定的基线，从而显著提升定量实验的精确度以及重复管之间的数据重现性。需要注意的是，不同仪器对ROX的要求有所不同。在基线PCR的初始几个循环中，荧光信号几乎没有变化，阈值设定应当在可靠的最小荧光值基础上进行，该阈值为CT值扩增曲线与阈值的交点横坐标。

### 结果有效性判断

1. 融解曲线应表现为单峰（染料法），且扩增曲线应具有显著的指数扩增区域。

2. 复孔间CT值的标准差（STD）应小于0.2.

3. 阈值应合理设置，务必位于指数增长期。虽然仪器会自动计算阈值，但并不是所有情况下的计算结果都合理，必要时需要手动调整。

### NTC及NRT的确认

NTC（无模板对照）用于确认无气溶胶污染，其设置应为qPCR反应中的水替代模板；若ΔCT=NTC(CT值)-目的基因(CT值)≥3或≥5，表示体系中气溶胶污染不会影响实验结果的准确性。

NRT（无逆转录对照）则用于确认无基因组残留，其设置通常为在逆转录反应中，除逆转录酶组分外正常添加其他组分；若ΔCT=NRT(CT值)-目的基因(CT值)≥3或≥5，同样可以判断体系中基因组残留对实验结果的准确性无显著影响。

待测的CT值应在线性范围内，且扩增效率符合约定标准，PCR扩增效率(e)应保持在90%-120%之间。

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