在生物医疗研究领域，当科研人员谈论他们珍贵的RNA样品时，我们常常听到“快把试管放到冰上！”和“希望别让它降解”的呼喊。RNA本身在分子生物学研究中不如其他大分子（如DNA或蛋白质）稳定。因此，CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（即“gRNA”）也面临着“易碎性”问题。

为了解决这个问题，现在有研究表明，通过化学修饰可以增强gRNA的稳定性，同时保持其引导Cas9产生特异性切断的能力。这些gRNA技术的进步不仅提升了靶向效率，还减轻了对RNA状况的无谓担忧。一些gRNA的修饰甚至不仅增加了稳定性，还赋予了其不同的“颜色”，或改变了其激活特性。

稳定的gRNA修饰涉及磷酸糖骨架的改造，CRISPR/Cas9靶向识别序列由20个核苷酸的gRNA导向，后者是较大CRISPR RNA（crRNA）的一部分。除了20个核苷酸的引导序列外，crRNA的3'末端还包含一个大约20个核苷酸的重复区域，该区域与Cas9蛋白的相互作用有关。这类RNA分子易受到细胞质和核酸酶的攻击，因为它们会被视为外源RNA。为保护这些RNA不被降解，现在有几种简单的方法可以修饰RNA的糖或磷酸基团，以提高其稳定性。

令人惊叹的是，自然界早已进化出防止重要RNA分子降解的机制，其中最常见的是2'-O-甲基化，该过程将甲基添加到核糖的2'羟基，以保护RNA不受降解。另一种稳定的修饰是2'-氟（2'-F），它用氟取代了该位置的羟基。此外，3'-硫代磷酸酯键的形成是另一种流行的修饰，其中硫替代了桥接磷酸的氧。这些有用的骨架修饰包括酰胺键、锁定核酸和受限乙基等。

那么，哪种RNA骨架修饰效果更佳呢？研究表明，将多种修饰结合使用，例如硫代磷酸酯和2'-O-甲基修饰，能提供更强的稳定性。这些修饰可以通过市售试剂盒在实验室合成，也可以在购买gRNA时定制。推荐将修饰应用于crRNA分子的末端，以达到最佳的稳定性和有效性。

此外，提高gRNA效率的一个简单方法是用脱氧核苷酸替代几种核糖核苷酸。含有部分DNA的gRNA在面对Cas9蛋白时展现出了意想不到的耐受性，进而提升靶向效率。同时，锁定核酸和桥接核酸也可以引入到gRNA中，这些改性使RNA的构象更加受限，提升了对错配的判断能力，并增强了抗核酸酶的能力，从而减少了脱靶现象。尽管两者都具有明显的优势，但N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率略高且毒性较小。

值得一提的是，上述的多种RNA稳定修饰，很多是在CRISPR/Cas9技术之前就为siRNA和反义寡核苷酸开发的。某些合成修饰，特别是那些不含5'-三磷酸盐的gRNA修饰，能够降低外源RNA引发的先天免疫反应，这在影响活力的实验中尤为重要。

在gRNA修饰的最新进展中，研究者们借助可光激活和可光切割的gRNA，有效地克服了降解问题。通过在gRNA的20nt靶向序列中引入一个可光切割的2-硝基苄基接头，这些gRNA在适当光照的短暂暴露下便会失效。此外，利用被光封闭的gRNA在几秒内释放出活性，可以顺利启动CRISPR/Cas9靶向编辑事件。所有这些技术都证实了化学修饰RNA的潜力，并使得通过简单的LED灯控制整个编辑过程成为可能。

在靶向实验中为gRNA染色可以帮助视觉化转染效率，甚至在细胞实验中追踪其位置。可供选择的染料种类繁多，您可以选择使用试剂盒进行DIY，或选择购买预标记的商业合成染料。如果您希望标记crRNA或tracrRNA，也可以根据需要进行选择。在单一向导系统（即crRNA和tracrRNA结合为一个分子）中，虽然可能不需要进行染料标记，但还是可根据具体需求灵活选择。

通过对上述技术的理解，相信您在CRISPR/Cas9实验模块的学习上已有了全新的见解。如果您对Cas蛋白相关的产品有需求，尊龙凯时人生就博即将推出CRISPR/Cas系列蛋白产品，期待与您在生物医疗领域的再次相遇，为您的科研提供更加优质的支持。